Amplification in vitro et discrimination des formes fibrillaires d’α-synucléine présentes dans le liquide céphalo-rachidien de patients atteints de synucléinopathies en vue de leur stratification moléculaire

Objectif(s) de la recherche et intérêt pour la santé publique

Finalité de l'étude

Objectifs poursuivis

Domaines médicaux investigués

Bénéfices attendus

Les synucléinopathies, telles que la maladie de Parkinson (MP), la démence à corps de Lewy (DCL) ou l’atrophie multisystématisée (AMS), sont des maladies neurodégénératives (MND) ayant pour caractéristique commune l’agrégation de l’α-synucléine (α-syn) dans les cellules du système nerveux central. A ce jour, il n'existe aucun test diagnostique validé pour la distinction entre ces affections lors du vivant, et seule l'analyse anatomo-pathologique post-mortem permet leur confirmation. A l’instar des prions, l’α-syn, physiologiquement enrichie au niveau synaptique, peut s’agréger, se transmettre d’une cellule à une autre, recruter la protéine normale et induire elle-même son agrégation, dans un processus auto-catalytique aboutissant à la propagation de la pathologie cérébrale, et la neurodégénérescence progressive dans les tissus atteints.
Dans la MP et la DCL, l’α-syn s’agrège principalement dans les neurones sous forme d’inclusions comme les corps de Lewy (CL), tandis que pour l’AMS, cette accumulation est observée majoritairement dans les oligodendrocytes sous forme d’inclusions gliales cytoplasmiques (IGC). De nombreuses recherches tendent à montrer que ces distinctions phénotypiques entre synucléinopathies, qui rappellent les différentes souches de prions, ont une origine moléculaire déterminée par la structure des assemblages amyloïdes adoptée par l’α-syn agrégée. En utilisant le caractère réplicatif de ces protéines impliquées dans des MND, des techniques d’amplification in vitro des agrégats ont été développées : la PMCA (protein misfolding cyclic amplification) et le RT-QuIC (real-time quaking induced conversion). Ces procédures permettent la production de quantités détectables d’amyloïdes à partir d’échantillons en contenant des doses infimes - comme le liquide céphalo-rachidien (LCR) par exemple - en ensemençant avec ces derniers un substrat de protéine normale, ce qui représente un intérêt diagnostique majeur . Par ailleurs, ces techniques appliquées à des échantillons de syndromes parkinsoniens atypiques (SPA) ne présentant pourtant pas d’agrégation significative de l’α-syn, tels que la paralysie supranucléaire progressive (PSP), ou la dégénérescence cortico-basale (DCB), ou même de certains signes précurseurs de la MP comme les troubles du sommeil paradoxal (TSP), ont pourtant abouti à la détection de formes amyloïdes de la protéine.
L’apparition de ces structures fibrillaires durant les réactions d’amplification in vitro est mesurée à l’aide d’une sonde fluorescente : la Thioflavine T (ThT). Cependant, il a été très récemment montré que l’α-syn agrégée amplifiée du LCR de patients MP et AMS montrait des intensités de ThT très distinctes bien que contenant des quantités d’amyloïdes comparables. Au laboratoire, nous avons très récemment fait une découverte surprenante : des structures fibrillaires d’α-syn ThT-négatives (qui auraient donc échappé à la détection par les techniques sus décrites) sont capables de se répliquer à l’identique in vitro et dans des neurones en culture et se sont avérées être particulièrement neuro-invasives in vivo. Celles-ci pourraient correspondre aux amyloïdes associés à l’AMS décrits dans les travaux d’autres équipes. D’ailleurs, la structure des fibres d’α-syn retrouvées dans un cerveau AMS sont de structure différente que celles initialement décrites pour la MP. Nous avons donc développé, à l’aide d’autres sondes fluorescentes (le SybrGreen et le X-34, dérivé du rouge congo) une technique multiplexée nommée fibrilloscope, permettant de déterminer facilement les caractéristiques structurales des fibres d’α-syn, et qui peut être utilisée sur les produits d’amplification des amyloïdes contenus dans des échantillons provenant de patients atteints de diverses maladies neurodégénératives.
Si, comme l’indiquent nos résultats préliminaires, les caractéristiques structurales des amyloïdes sont maintenues durant leur réplication in vitro, nous serons à même de différencier les synucléinopathies et les syndromes parkinsoniens atypiques ou précoces, en analysant les propriétés des fibres d’α-syn sur les produits d’amplification de LCR de ces patients.